酶切法PCR-Free建库,1h/1ng极速建库

来源: 上海翊圣生物科技有限公司   2020-10-17   访问量:690评论(0)

酶切法PCR-Free建库,1h/1ng极速建库

高通量测序中,常规的文库构建需要PCR扩增,一方面,是为了对微量DNA样本进行扩增,提高文库产量,另一方面,可以放大荧光信号,让测序仪更容易捕获和识别荧光信号,提高测序准确度。但是,PCR就像一把“双刃剑”,在解决了样本起始量低的问题并起到放大荧光信号作用的同时,也引入了扩增错误和偏向性,不能完美地呈现基因组序列真实面貌。因此,PCR-Free技术的引入,既具备PCR的优势,也克服了PCR的缺点。

图1:PCR-Free技术优势

酶切法PCR-free建库试验验证

实验目的:

验证酶切法PCR-free建库试剂盒最低样本投入量。

实验描述:

不同来源样本,不同投入量,统一酶切12min不分选,进行PCR-free建库,使用qubit定量文库并通过2100核实文库条带分布。

结果展示:

建库信息

12209试剂盒(片段化/末修/加A+接头连接)

模板

NA12878

小牛胸腺

E.coli

编号

A1

A2

A3

A4

A5

A6

A7

A8

A9

A10

A11

A12

A13

A14

A15

投入量-ng

1

5

10

50

145

1

5

10

50

180

1

5

10

50

186

回溶体积-μl

5

10

10

21

21

5

10

10

21

21

5

10

10

21

21

Qubit-ng/μl

0.25

0.6

1.23

3.02

8.72

0.29

0.5

1.31

3.5

11

0.22

0.55

1.43

3.46

11.4

产量-ng

1.25

6

12.3

63.42

183.12

1.45

5

13.1

73.5

231

1.1

5.5

14.3

72.66

239.4

注:由于部分接头残留,Qubit检测文库浓度最终大于样本的投入量。

注:由于Y接头结构的影响,2100不能准确分析PCR-free真实文库大小;电泳图-文库主带约在380-400bp。

图2:A5、A10、A15 PCR-free文库电泳图及A3、A8、A13 2100峰图

结论:

酶切法PCR-free建库试剂盒,样本最低投入可低至1ng。

机械法PCR-free建库试验验证

实验目的:

对照试验,实验条件与上述酶切建库一致,验证低投入量机械法建库产量与酶切法差别。

实验描述:

不同来源的样本,统一机械打断,用相同的比例分选出300bp大小的插入片段,选择投入1/5/10 ng分选产物进行PCR-free建库,使用qubit定量文库并通过2100核实文库条带分布。

结果展示:

建库信息

12201(末修/加A+接头连接)

模板

NA12878

小牛胸腺

E.coli

编号

B1

B2

B3

B4

B5

B6

B7

B8

B9

投入量-ng

1

5

10

1

5

10

1

5

10

回溶体积-μl

5

10

10

5

10

10

5

10

10

Qubit-ng/μl

0.256

0.59

1.2

0.28

0.53

1.01

0.24

0.52

1.13

产量-ng

1.28

5.9

12

1.4

5.3

10.1

1.2

5.2

11.3

注:由于部分接头残留,Qubit检测文库浓度最终大于样本的投入量。

注:超声分选模板-主带大小300bp,即PCR-free文库大小约420bp

图3:超声分选模板2100峰图(左)及B3、B6、B9文库2100峰图(右)

结论:

机械法PCR-free建库试剂盒,1/5/10 ng投入文库产与酶切法相近。

根据Qubit值判断,酶切法PCR-free建库高低投入量均有文库产出,且低投入量文库产出与机械法PCR-free建库相当。文库2100峰图显示PCR-free文库有微量接头残留,实验时接头用量需根据实际情况进行调整。(注:实际样本操作时,建议选用qPCR文库定量,可更直观显示有效文库产量)

由上述两个实验可以看出,酶切法PCR-free建库低投入量实验完全可以达到机械法建库的效果,而且建库流程精简,无需复杂的机械片段化过程,一步完成片段化/末端修复/加A ,1h即可完整体的建库流程,目前快速建库的不二之选。

产品推荐

Hieff NGS® OnePot PCR-free DNA Library Prep Kit

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化了末修加 A 以及接头连接体系,极大增加了文库转化效率,适合用于病原微生物 mNGS 领域的快速建库。

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4)品质稳定:严格的批次性能与稳定性质控

 

产品类型

名称

货号

建库试剂盒

Hieff NGS® OnePot PCR-free DNA Library Prep Kit

12209ES08/24/96

片段化/末修/加A模块

Hieff NGS® Fast-PaceTM DNA Fragmentation Reagent

12609ES24/96

快速连接模块

Hieff NGS® UltimaTM DNA Ligation Module

12604ES24/96/98

长接头

Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®

12615/6/7/8ES04/16

磁珠

Hieff NGS® DNA Selection Beads

12601ES03/08/56/75

文库定量

dsDNA HS Assay Kit for Qubit®

12640ES60/76

Hieff NGS® Library Quantification Kit for Illumina®, qPCR Master Mix

12302ES05/09

Hieff NGS® Library Quantification Kit for Illumina®, DNA Standard 1-6

12307ES09



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