干货分享|qPCR复孔平台期荧光信号不同会影响实验结果吗?

来源: 上海翊圣生物科技有限公司   2020-10-17   访问量:908评论(0)

干货分享|qPCR复孔平台期荧光信号不同会影响实验结果吗?

王老师:您好,最近用你们的试剂跑qPCR,复孔平台期的荧光信号不同,这样的结果能用吗?

小翊:您好,老师。从图中来看,复孔重复性是比较好的,Ct值<0.5, 这个结果没什么问题的

王老师:那为什么复孔的平台期信号还有相差呢?有什么方法可以使复孔荧光信号一致吗?

最近有不少客户咨询小翊类似的问题,担心这样的数据不可靠今天小翊就帮您解除疑虑

复孔平台期不同影响实验结果Ct<0.5

众所周知,理想的PCR扩增是使DNA分子由1变2,2变4,以2n进行扩增的。但实际上,随着循环数的增加,体系中的Taq酶、dNTP、引物等逐渐被消耗并伴随着副产物的生成,使得PCR不能呈指数扩增,从而使实际的扩增曲线呈现“S”型,通常分为基线期、指数增长期和平台期三个阶段,如图1。

基线期是指PCR最开始的3-15个循环时期,这段时期扩增是存在的,但因循环次数较少,体系中双链DNA积累较少,荧光信号强度没有超过荧光本底信号,此时的荧光值对于机器来说很难准确检测。指数扩增期是指PCR产物的量增长最快的一个时期,理想条件下,是呈指数增长的,在这个时期由于样品间的细小误差尚未放大,所以复孔的荧光信号在这个时期相对一致。通常荧光阈值需要设置在此时期,荧光信号达到荧光阈值所经历的循环数称之为Ct值,故各复孔间的Ct值有较好的重复性(△Ct<0.5)。而平台期是指由于原料耗尽、反应副产物的产生等原因使得扩增变得缓慢的一个时期。此时期经过的循环次数较多,使样品间的细小差异被无限放大,从而导致复孔间平台期的荧光信号相差很大。

图1 扩增曲线的三个阶段

下面为大家展示一个案例,以293T-cDNA的20倍稀释液为模板,扩增GAPDH基因,90个复孔(如图2)。



2 同一样品的90个重复的扩增曲线图

由图可以看出该实验的复孔重复性非常好,Ct<0.5,符合MIQE标准。但平台期的荧光信号值均有差异。

综上:数据的有效性和复孔平台期荧光信号关系不大,主要与复孔间的△Ct有关,MIQE标准是△Ct<0.5。

在复孔Ct<0.5的情况下,复孔平台期不同并不影响实验结果,但是有没有办法可以让复孔平台期荧光信号尽量一致呢?

使复孔平台期荧光信号趋于一致的秘诀

1、确保加样的准确性

1)qPCR各组分完全化冻需要混匀。

2)采用预混的方式进行加样,保证体系的均一性。可以将除模板以外的试剂进行预混,分注至各管中

3)模板浓度高时,可将模板稀释,提高加样体积,减少加样误差

2确保移液的精准度

加样过程需确保移液枪未出现漏气漏液的情况,避免使用精准度差的移液枪或者不配套的枪头。

3体系混匀并进行离心

体系加完后要用移液枪吹打进行离心,以防试剂挂壁或者体系中有气泡造成实验结果不准确。

4、qPCR试剂的选择:选择“预混液”形式的qPCR试剂,反应体系只需加入引物和模板,大大简化实验的操作步骤,减少了加样误差。

好了,读到这里,应该不会再用纠结复孔平台期荧光信号不同的事了吧?为了简化您的qPCR实验操作,让您的qPCR数据更完美,小翊为您推荐一SYBR Green预混液:Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix(Cat NO.11184ES)该产品是预混液形式的qPCR试剂,另外适合于所有的qPCR仪器平台如图3,兼容快速程序可以大大简化您的实验操作并能保证您实验结果准确性。

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