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来源: 武汉金开瑞生物工程有限公司   2020-8-10   访问量:456评论(0)

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2020年8月11日20:00
金开瑞第三期直播LIVE等你来!
和往期一样,在直播开始之前,先来了解一下我们本场“直播新秀EMSA”。

EMSA技术简介
凝胶迁移或电泳迁移率检测(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)是一种检测蛋白质和DNA相互结合的技术,主要研究DNA结合蛋白与其相关的DNA相互作用。

实验原理
基于蛋白-探针复合物在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。当DNA探针与目的蛋白混合孵育时,目的蛋白可以与末端标记的DNA探针结合,形成DNA探针-蛋白复合物,电泳时由于这种复合物比无蛋白结合的探针分子量更大,所以在凝胶中迁移的速度慢,即表现为相对滞后。
DNA探针-目的蛋白复合物如果在膜上形成一条滞后条带,说明目的蛋白与DNA探针发生互作,反之则不结合。
a) 实验设计说明
根据研究目的合理设计特异性探针,还可根据需求设计突变探针或竞争性探针实验。
b) 样本制备
可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白:总蛋白/核蛋白一般涉及超迁移,需要提供目的蛋白IP级别抗体;纯化好的蛋白则涉及重组表达,需要考虑目的蛋白重组表达难度。
c) 探针制备
根据实验设计合成5’端生物素标记的引物,退火后形成生物素标记的双链DNA探针。
注意事项
a) 重组蛋白:
蛋白尽量上清表达,且蛋白纯度需>80%
b) 核蛋白样品的制备:
注意用专用的核蛋白抽提试剂来做,才能使制备的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和构像;掌握好核蛋白的浓度和纯度,尤其是浓度;蛋白来源建议选择细胞(便于核蛋白提取)。
c) 探针的制备:
建议合成生物素标记的引物直接进行退火;如果先合成探针再标记,可能会影响标记效率。
d) 探针长度选择:
目的DNA的长度应小于300bp,太长会产生过多结合位点导致结果分析困难,还会产生超级螺旋结构而掩盖结合部位。建议选用短的寡核苷酸片段(60bp以内),这样可以确定具体的结合位点。
EMSA技术案例分析
a) 验证性EMSA(设计多个探针,确定结合位点)

The EMSA results of binding of AlgR to the rsmX/Y/Z promoter sequence.
From:The Pseudomonas transcriptional regulator AlgR controls LipA expression via the noncoding RNA RsmZ in Pseudomonas protegens Pf-5.
小结:EMSA设置阴性对照和阳性对照;同时验证AlgR蛋白与rsmX/Y/Z三段启动子区域结合情况,发现只有rsmZ+AlgR有滞后条带。
说明:AlgR蛋白可以与rsmZ启动子区域结合。
b) 验证性EMSA(设计WT和MUT探针)
From:The tomato HD-Zip I transcription factor SlHZ24 modulates ascorbate accumulation through positive regulation of the D-mannose/L-galactose pathway.
小结:在明确结合位点的情况下设计野生型和突变型DNA探针,EMSA电泳时野生型DNA探针和纯化蛋白结合的复合物比无蛋白结合的DNA探针在凝胶中泳动的速度慢,显色后出现滞后条带;而突变型DNA探针则无滞后条带。
说明:SIHZ24蛋白可以与SIGMP3启动子结合。
c) 竞争性EMSA(设计标记和未标记探针)

From:Manipulation of Light Signal Transduction Factors as a Means of Modifying Steroidal Glycoalkaloids Accumulation in Tomato Leaves.
与探针序列相同,不标记修饰基团的DN**段称为冷探针(竞争探针)。
作用:冷探针含有和探针相同的DNA序列,会干扰探针与蛋白的结合。在电泳图的相应位置处,电泳带的的信号减弱或消失。
优点:探针和蛋白的结合未必是特异性结合,或者蛋白本身可能含有生物素,二者均能产生假阳性的实验结果。增加一个冷探针的干扰实验,可以排除假阳性结果,增加实验结果的准确性。
d) 超迁移EMSA(需要IP级别抗体)

From:Transcriptional regulation of microRNA-126a by farnesoid X receptor in vitro and in vivo.
小结:提取核蛋白后EMSA检测蛋白FXR与miR-216a启动子结合情况,由于核蛋白是混合蛋白,所以需要确定目的蛋白FXR则需要加入Anti-FXR进一步确认,发现DNA-蛋白滞后条带上方出现DNA-蛋白-抗体更滞后的条带(即超迁移)。
说明:核蛋白中与miR-216a启动子结合的蛋白是FXR。
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