打破假说!Cir Res:心力衰竭并非线粒体高度乙酰化导致

来源: 上海中科新生命生物科技有限公司   2020-8-5   访问量:1196评论(0)

心力衰竭是由心脏功能性疾病等导致心室充盈或射血能力受损而引起的一组综合征,几乎所有心血管疾病都可导致心衰发生。许多间接证据表明,心力衰竭的发生与线粒体蛋白的翻译后修饰(包括赖氨酸乙酰化)密切相关,这一认识已经成为一种广为接受的理论假说。然而,乙酰化是否真正损害线粒体功能从而促进心衰,却一直未得到有力的证据来证实。

2020年7月,美国杜克大学分子生理研究所在《Circulation Research》(IF=14.5)上发表”Extreme Acetylation of the Cardiac Mitochondrial Proteome Does Not Promote Heart Failure“ 的研究文章,研究从心衰发生机制中一种广为接受的假说(高度乙酰化会损害线粒体功能从而促进心衰)入手,通过构建基因敲除动物模型、乙酰化蛋白组分析和生理病理表型检测,证明了高度乙酰化并不会损害线粒体功能,且不会引发或促进心脏功能障碍。这一发现,打破了之前对线粒体蛋白高度乙酰化促进心衰的广泛认识。

心肌线粒体蛋白高度乙酰化不会导致线粒体能量流破坏及心衰

研究材料

1. C57BL/6NJ心肌条件性双敲除小鼠系DKO: CrAT/Sirt3M−/−和对照系DFC:CrAT/Sirt3fl/fl双心室心肌组织;

2. 单敲小鼠系S3KO:Sirt3M−/−和对照系S3FL(Sirt3fl/fl)双心室心肌组织;

3. 野生型心衰模型组(TAC-MI)和假手术组(Sham)双心室心肌组织;

4. DKO-TAC,DFC-TAC,DKO-Sham,DFC-Sham组双心室心肌组织。

技术方法

TMT乙酰化修饰蛋白组分析,TMT蛋白组分析

实验路线图

研究结果

1.双敲除CrAT和Sirt3对心肌线粒体乙酰化的影响

为了获得心肌线粒体蛋白高度乙酰化状态的动物模型,作者构建了肉毒碱乙酰基转移酶CrAT和去乙酰化酶Sirt3双敲除(DKO)、及Sirt3单敲除(S3KO)小鼠。随后,利用乙酰化蛋白组分析心肌线粒体乙酰化变化,发现:差异的乙酰化肽段有84%属于线粒体蛋白,与对照组比较,线粒体乙酰化(Kac)位点在DKO中增加98%。在S3KO中增加95%,其中98%线粒体Kac在DKO中比S3KO中更加丰富。

同时,作者通过第二组乙酰化蛋白组学分析双敲除(DKO)、对照组(DFC)、野生型心衰模型组(TAC-MI)和假手术组(Sham)的心肌线粒体乙酰化水平,结果发现:85%的线粒体Kac在TAC-MI中比在Sham中丰度有显著升高。DKO与TAC-MI比较,则有94%的线粒体Kac更加丰富。以上说明,敲除Sirt3能显著增加心肌线粒体的乙酰化水平,而双敲除CrAT和Sirt3能使其乙酰化水平达到更高。

乙酰化蛋白组分析发现CrAT和Sirt3双敲除可增加心肌线粒体乙酰化赖氨酸残基的数量

2.CrAT和Sirt3双敲除对线粒体生物能的影响

通过建立线粒体生物能评估平台,检测了DKO与DFC的心肌线粒体生物能水平。结果显示:呼吸由脂肪酸供能(Oct/M)时最大𝐽O2略有减少。脂肪酸+丙酮酸盐+L-肉碱(Oct/Pyr/M/Carn)混合物支持时,最大𝐽O2与氧化还原状态有轻微转变。而其他检测组别指标均无明显变化。说明DKO与DFC两组线粒体生物能整体上没有太大差异。

双敲除CrAT和Sirt3对线粒体生物能影响很小

3.CrAT和Sirt3双敲除对压力超负荷引起的心功能不全的影响

由于线粒体可能不能完全重现体内的生物能情况,作者设置了体内实验。通过TAC建立压力超负荷模型,结果发现:DKO组存活率并没有更易受TAC的影响,缩短分数也没有显示显著差异。DKO与DFC组间的心脏功能、血流动力学、心肌肥大程度及心衰标志物水平同样没有显著差异。说明CrAT和Sirt3敲除不会促进压力超负荷引起的心功能障碍。

CrAT和Sirt3双敲除不会促进压力超负荷引起的心功能不全

4.TAC对心肌线粒体乙酰化水平和蛋白表达的影响

进一步,作者收集心脏功能检测时各处理组小鼠(DKO-TAC,DFC-TAC,DKO-Sham,DFC-Sham)手术16周后的双心室心肌组织,开展了乙酰化蛋白组分析,结果发现:92%线粒体Kac位点在DKO-Sham中相对DFC-Sham有显著升高。DKO-TAC与DFC-TAC比较也有95%线粒体Kac位点升高。但是,不管DKO还是DFC,处理16周的TAC组与Sham组比较均没有增加线粒体乙酰化组的水平。可能是慢性TAC实验过程中线粒体碳分解代谢的逐渐减少导致乙酰化修饰的增加减少。

同时,蛋白组学分析比较了两组模型间(TAC-MI: Sham,DFC-TAC: DFC-Sham)表达差异的蛋白情况,结果显示:两组模型一致变化的差异蛋白质有522个,在脂肪酸分解代谢及相关过程有显著下调。TAC-MI与Sham比较表达差异的蛋白没有显著富集。TAC与Sham比较表达差异的蛋白在线粒体电子传递链复合物I和TCA循环有显著减少。说明16周的TAC不会增加心肌线粒体乙酰化修饰,但氧化代谢和线粒体含量会广泛地减少。

TAC不会加剧线粒体高乙酰化,但会减少复合物I的表达

小编小结

该篇文章通过条件性双敲除CrAT、Sirt3使心肌线粒体蛋白达到极度乙酰化状态(通过乙酰化蛋白组学分析证实),而双敲小鼠系(DKO)的线粒体能量流,包括底物特异性脱氢酶活性、呼吸反应、氧化还原电荷、线粒体膜电位等,却很少发现有氧化功能不足的证据。DKO小鼠系心脏也没有引发或更易受到主动脉缩窄引起的压力超负荷带来的功能障碍影响。因此,这一发现打破了“高度度乙酰化会引起线粒体氧化机制的广泛破坏,从而威胁心肌代谢弹性”的假说。

中科新生命修饰蛋白质组学产品线

采用进口金标抗体,高标准富集操作拥有领先的高水平合作文章



上海中科新生命生物科技有限公司   商家主页

地址:上海市园美路58号1号楼15-18楼
联系人:刘
电话:021-54975031
传真:021-54975030
Email:liliu@aptbiotech.com;liliu@sibs.ac.cn