项目文章| 心血管疾病新靶点!同济医学院胡波团队解析动脉粥样硬化新靶点作用机制

来源: 上海中科新生命生物科技有限公司   2020-7-7   访问量:632评论(0)

动脉粥样硬化 (atherosclerosis, AS) 是临床常见疾病,与冠心病、脑梗死等密切相关,虽已有相关治疗药物(如他汀类),但疗效有限、副作用等限制了其临床使用,因此,寻找疾病新治疗靶标仍极为迫切。

2020年3月,华中科技大学同济医学院胡波教授团队在《Autophagy》(IF=9.77) 杂志上发表题为“The P2RY12 receptor promotes VSMC-derived foam cell formation by inhibiting autophagy in advanced atherosclerosis”的文章,发现了治疗动脉粥样硬化的新靶标—P2RY12受体,结合分子生物学、磷酸化蛋白质组学等方法,解析了P2RY12受体介导晚期动脉粥样硬化进程的分子机制。中科新生命有幸参与了磷酸化蛋白质组学检测与数据分析工作。

实验材料

人颈动脉斑块、apoe-/-小鼠主动脉斑块(动脉粥样硬化模型)、血管平滑肌细胞等

实验分组

动脉粥样硬化患者(ATV组、CDL +ATV组)、疾病小鼠(ctrl组、ATV组、CDL +ATV组)、血管平滑肌细胞(ctrl组、ADPβs组、2-MeSAMP组、ADPβs+2-MeSAMP组)等

技术路线

研究结果

治疗效果:P2RY12受体抑制剂(CDL)与阿托伐他汀(ATV)有协同作用

ATV是常见的抗动脉粥样硬化药物,为了确认CDL和ATV是否有协同作用对产生颈动脉斑块的患者进行了给药测试。患者接受20 mg/d ATV或75 mg /d CDL +20 mg ATV,治疗后6个月通过超声分析最大颈动脉斑块厚度(MCPT)判断疗效。结果表明,在37例ATV治疗患者组和37例ATV + CDL治疗患者组中,与ATV组相比,ATV + CDL组的MCPT降低更为明显。进一步在apoe-/-小鼠(动脉粥样硬化模型)中验证,与不给药(对照组)相比,ATV和ATV + CDL给药组可将动脉粥样硬化病变区域显著减少至9.2±0.9%和5.8±1.1%。以上表明,CDATV给药能协同缓解动脉粥样硬化进程。

图1. ATV和CDL发挥协同抗动脉粥样硬化作用

表型分析:CDL可改善晚期动脉粥样硬化中的脂质聚积和血管平滑肌细胞衍生的泡沫细胞形成

泡沫细胞是导致动脉粥样硬化斑块的重要原因,其形成主要(50%)源于血管平滑肌细胞(VSMC)吞噬大量脂肪,形成胞浆中含有脂滴的病理细胞。以往研究表明,P2RY12受体在VSMC中大量表达,且在动脉粥样硬化的发展过程中上调。为确认P2RY12受体是否参与泡沫细胞形成,测试了对照组与CDL加药组的小鼠主动脉斑块的脂质沉积与VSMC衍生的泡沫细胞数量,结果表明,CDL组相对于对照组的斑块面积减少,脂质沉积减少,泡沫细胞数量减少(ACTA2 + BODIPY +或PDGFRB + BODIPY +标记细胞数量)。

图2. CDL改善晚期动脉粥样硬化中脂质聚积和VSMC衍生的泡沫细胞形成

机制解析

1)体外实验发现P2RY12受体通过抑制自噬降低胆固醇外排,促进VSMC衍生的泡沫细胞形成

为解析P2RY12受体调节VSMC衍生的泡沫细胞形成机制,采用P2RY12受体激动剂ADPβs、与P2RY12受体拮抗剂2-MeSAMP(CDL代替拮抗剂)在VSMC细胞水平上进行研究。VSMC中的脂质蓄积可能是由胆固醇外排的变化引起的,故测试了ADPβs、2-MeSAMP及ADPβs+2-MeSAMP对胆固醇外排的影响,研究表明,ADPβs抑制了胆固醇对APOA1和HDL外排,而在ADPβs+2-MeSAMP组中,2-MeSAMP处理则逆转了ADPβs对胆固醇外排的抑制。以上表明,P2RY12受体通过抑制胆固醇外流来促进VSMC衍生的泡沫细胞形成。

图3. P2RY12受体通过抑制自噬降低胆固醇外排,促进VSMC衍生的泡沫细胞形成

那么,P2RY12受体抑制胆固醇外流的机制是什么?以往研究发现,胆固醇外排依赖溶酶体酸脂肪酶A(LIPA)产生的游离胆固醇,表明溶酶体自噬相关途径可能参与该过程。为证明该假设,首先,采用自噬通量报告基因实验,发现ADPβs处理使自噬体和自溶酶体数量均显著减少,说明P2RY12受体激活抑制了自噬溶酶体途径。通过免疫荧光分析、电镜分析等实验,检测了脂滴(LDs)、胆固醇与自噬体之间的关联,证明在P2RY12受体激活后,由于自噬抑制,导致胆固醇外排抑制、脂质堆积,最终引发泡沫细胞形成。

图4. P2RY12受体通过抑制自噬降低胆固醇外排

2)磷酸化蛋白质组深入挖掘P2RY12受体调控自噬的信号通路PI3K-AKT-mTOR

为深入挖掘P2RY12受体调节VSMCs自噬的机制,采用磷酸化蛋白质组进行信号通路图谱绘制。KEGG通路展示可能调控机制:P2RY12受体通过PI3K-AKT-mTOR途径抑制自噬。随后,通过WB验证通路中关键蛋白(mTOR、EIF4EBP1 / 4E-BP1、ULK1)等磷酸化水平变化,发现P2RY12受体激活诱导了mTOR、EIF4EBP1、ULK1的磷酸化增加, 证实其通过改变mTOR的活性来调节自噬体的形成。为了进一步证实mTOR参与调节胆固醇外排和脂质沉积,使用雷帕霉素(Rapamycin)阻断了mTOR的活性,发现胆固醇外排增加、脂质沉积减少,而Rapamycin+ADPβs处理组中,Rapamycin逆转了ADPβs对胆固醇及脂类的调控。以上表明,P2RY12受体通过PI3K-AKT-mTOR途径抑制自噬,促进脂质沉积。

图5. P2RY12受体通过PI3K-AKT-mTOR途径抑制自噬,促进脂质沉积

3. 体内验证: P2RY12受体抑制通过PI3K-AKT-mTOR促进疾病小鼠体内VSMC自噬

最后,体内实验证明在晚期动脉粥样硬化小鼠(apoe-/-)中,使用CDL抑制剂处理,P2RY12受体抑制是通过PI3K-AKT-mTOR途径促进了小鼠体内VSMC的自噬发生,缓解疾病进程。

小编总结

本文从动脉粥样硬化治疗新靶点—P2RY12受体出发,先通过对患者治疗、动物模型试验确认该受体抑制剂的疗效。随后,在细胞水平(体外试验),结合分子生物学与磷酸化蛋白质组学等方法,解析了P2RY12受体活化后通过PI3K/AKT信号途径促进自噬关键分子mTOR磷酸化,抑制VSMCs来源的泡沫细胞自噬,阻止细胞内脂滴降解促进其泡沫化,最终导致斑块脂质核心变大和斑块进展。最后,回到动物水平(体内试验)验证了该信号通路介导自噬的机制。

该文是解析疾病治疗靶点、挖掘调控机制的优秀文章。不难发现,利用磷酸化蛋白质组学高效锁定关键信号转导通路,是解析疾病治疗靶点作用机制的有效工具。中科新生命拥有多年的修饰蛋白质组分析服务经验,已协助客户在《Nature Genetics》《Cell Research》《PNAS》等高水平杂志发表多篇论文,目前还推出了创新DIA磷酸化修饰蛋白质组服务,欢迎感兴趣的老师前来咨询!

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