你需要知道的载体元件功能-选择合适正确的载体

来源: 上海吉凯基因化学技术有限公司   2019-12-13   访问量:1101评论(0)

mily:等线;mso-fareast-font-family: 等线;mso-hansi-font-family:等线;mso-bidi-font-family:宋体;color:black;mso-font-kerning: 0pt">亲和、纯化

体积很小,很少影响蛋白功能

V5

GKPIPNPLLGLDST

1.4

亲和、纯化

适用于基于抗体的纯化

GST

Large Protein

26

纯化、稳定蛋白

适用于谷胱甘肽纯化; 防止蛋白水解,但可能降低溶解度

三、荧光蛋白标记

关于荧光蛋白,前面有文章专门进行过介绍-选择最好的荧光蛋白-Light Up Your Research。文章中介绍了荧光蛋白的应用及选择荧光蛋白需要考虑的问题。对于细胞实验,载体上带有一个荧光蛋白可以很方便的观察细胞的转染效率,在选择荧光蛋白进行实验时,在前面文章的基础上补充如下几点:

1、 选择哪种荧光蛋白,可以结合后续的实验方案判断,比如后续实验是否需要进行免疫荧光WB,如有,那要避开相同颜色的荧光蛋白,好在目前有很多不同颜色的荧光蛋白和标记不同颜色的抗体可以选择

2、 相同细胞是否会同时转染不同病毒,如果会,那两个病毒需要带有不同的荧光蛋白,方便观察每种病毒的感染效率

3、 是否需要示踪定位目的基因的表达,如果需要目的基因与荧光蛋白融合表达,可以放在目的基因的N端,也可以放在目的基因的C端,放在哪里可以根据目的基因蛋白的功能决定,类似标签的位置。这样的构建方式可以帮助我们观察到目的基因是什么时候开始表达以及在哪里表达。如果不需要示踪定位目的基因,那可以考虑非融合表达,非融合表达有如下三种方式:

(1) 单独启动子启动,如SV40-EGFPCMV-ZsGreen1,或者EF1a-copGFP,这种结构理论上不会影响目的基因蛋白的功能。

(2) "self-cleaving" 2A结构,这里“自我切割”并不完全准确,因为这些肽被认为是通过使核糖体跳过2A元件C端的肽键合成而起作用的,从而导致2A序列末端之间的分离。切割发生在2A 序列C端的甘氨酸和脯氨酸残基之间,这意味着上游基因将在末端添加一些额外的残基,而下游基因将以脯氨酸开始。2A切割在真核细胞中是普遍的存在的,尽管一些科学家报告说其中的某些肽接近100%切割,但尚未就哪种肽效果最佳达成共识。特定2A肽的选择可能最终取决于许多因素,例如细胞类型或实验条件。常见的2A如下,前面增加的GSG三个氨基酸有利于增加2A的切割效率。

2A

氨基酸序列

T2A

(GSG) E G R G S L L T C G D V E E N P G P

P2A

(GSG) A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P

E2A

(GSG) Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P

F2A

(GSG) V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P

(3) IRES结构,IRES元件非常有用,通常在双顺反子载体中应用最多。但是其缺点是元件非常大(500-600 bp),可能会在包装能力有限的病毒转移载体中占据宝贵的空间。同时使用IRES元件一次表达两个以上的基因可能是不可行的。此外,科学家报告了IRES下游基因的表达较低,可能原因是由于细胞类型和特定基因等因素引起的。也有文献报告,IRES前面的基因大小不要超过1.5k有利于后面基因的表达效率。

四、真核抗性筛选标记

真核抗性筛选标记通常在慢病毒载体中使用最多,原因是慢病毒能够整合到基因组中,此时如果慢病毒载体带有有个筛选筛选标记,那会很方便的获得稳定细胞系。稳定转染的细胞可以被认为是与原始亲代细胞完全不同的细胞系。在选择使用哪种标记的载体需要考虑如下几点:

1、 相同细胞是否会同时转染不同病毒,如果会,那两个病毒需要带有不同的真核抗性筛选标记,方便后面感染效率的判断或者稳定细胞系的筛选

2、 哺乳动物细胞中没有一种推荐的浓度可供选择。在进行感染实验之前,需要确定所需的有效筛选的抗性浓度。合适的抗性浓度一般会使细胞在3-5天内死亡,抗性细胞会在10-14天内出现,具体取决于细胞分裂的速度及细胞对抗性的耐受程度。

3、 庆大霉素通常在哺乳动物细胞培养中用来抑制细菌生长,不适用于哺乳动物细胞的选择-请勿将其与G418(又名遗传霉素)混淆。

4、 新霉素不应用于哺乳动物表达,而应使用G418。 由于neo / kan基因赋予G418抗性,这可能会造成混淆。

常见的真核抗性筛选标记如下:

真核抗性

筛选周期

工作浓度

Puromycin

1-4

1-10 ug/mL

Hygromycin B

5-7

50-500 ug/mL

Blasticidin

1周以内

2-10 ug/mL

G418

7-14

100-800 ug/mL

,

基因递送方式通常有这么两种:(1)通过非病毒基因转移技术使用化学和物理方法将DNA传递到细胞中;(2)通过病毒基因转移技术使用病毒载体将基因转移到细胞中。特别是第二种方法,在基因治疗中使用尤为广泛,越来越多的病毒载体用于到基因治疗中,我们常见的有慢病毒载体,腺病毒载体,腺相关病毒载体等等。关于选择何种载体,我们吉凯基因前期举办过专门的在线课程-热门“工具病毒”载体的选择与应用指南,感兴趣的老师可以点回看。我们知道一个载体通常都由自己的启动子,标签,荧光蛋白标记,真核抗性筛选标记等这些元件组成,而且每种元件都会有不同的连接方式,那今天小编就简单介绍如何选择这些元件,希望通过这篇文章能够帮助您选择合适,正确的载体。

一、启动子

启动子通常分为三类:组成型/广谱启动子,组织/细胞基因特异性启动子,诱导表达启动子。

1、 组成型/广谱启动子:组成型启动子是在组成型启动子的调控下,不同组织器官和发育阶段的基因表达没有明显差异。组成型启动子的调控不受外界条件的影响,所启动基因的表达具有持续性,但不表现时空特异性,亦称之为非特异性表达启动子。常见组成型启动子如下:

启动子名称

启动子表达风度及应用

吉凯载体举例

UbC

中低丰度,干细胞、原代细胞、离体神经元

GV492

EF1a

强丰度,干细胞、血液来源细胞

GV400

CMV

强丰度,肿瘤细胞、原代细胞

GV314

SV40

中丰度

GV358

U6

III型,shRNAmicroRNA表达

GV493

PGK

中低丰度

CAG

强丰度,干细胞、原代细胞

CBG

强丰度

2、 组织/细胞基因特异性启动子:亦称之为器官特异性启动子,是指在该启动子调控下,外源基因的表达一般只发生在某些特定的器官或组织部位,并往往表现出发育调节的特性。其最大的优点是它所启动的外源基因在受体中仅在需要的部位特异表达,从而克服了组成型启动子启动的外源基因在受体中非特异、持续、高效表达所造成的浪费,增加转基因的效果。特别在腺相关病毒载体中,特异性启动子应用尤为广泛,吉凯基因部分特异性启动子列表:

启动子名称

启动子特性

hSyn

神经元特异性启动子

mecp2

较短的神经元特异性启动子

TUBA1A

早期神经元特异性启动子

c-fos

兴奋神经元启动子

CaMKIIa

前脑谷氨酸能神经元特异性启动子

hVGAT

GABA能神经元/中间神经元特异性启动子

Slc6a3

多巴胺神经元特异性表达启动子

gfaABC1D

星形胶质细胞特异性启动子

Iba1

小胶质细胞特异性启动子

CNP

少突胶质细胞或施万细胞特异性表达启动子

F4/80

小胶质细胞特异性启动子

CD68

小胶质细胞特异性启动子

3、 诱导表达启动子:指在某些特定的物理或化学信号的刺激下,该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平,常见是四环素诱导表达启动子,吉凯代表载体为GV308 TetIIP-MCS-3FLAG-Ubi-TetR-IRES-Puromycin (过表达慢病毒载体)GV307 TetIIP-TurboRFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Puromycin (干扰慢病毒载体)对于某些特定的有毒基因,使用诱导表达启动子载体是一个可行的解决方案,同时最近也看到过一篇文章,使用诱导表达启动子让基因进行一个短暂的表达,然后看表达前后细胞的变化。

二、标签

标签,通常是相对较小的氨基酸序列。如果您研究的是未鉴定的蛋白,或者尚未开发出优质抗体的蛋白(仅仅是因为您研究的蛋白具有可商购的抗体,那并不意味着它是优质的),那么您的第一步就是检测,免疫沉淀或将亲和标签融合到蛋白质上纯化蛋白质。标签选择建议:

1、 如果是编码基因,可以考虑增加一个标签,有利于后续的检测

2、 有些标签多串联几个,比如3*FLAG,3*HA等,可以增加检测的灵敏度

3、 标签的位置,理论上标签可以放在目的基因的5端和3端,通常默认放在基因的3端,但是具体需要根据目的基因的功能考虑,比如目的基因是否有信号胎,目的基因的C端后期是否会被切除等,这些因素都会决定标签的位置。

4、 有些标签较大,举例GST标签,可以考虑增加蛋白酶比如Thrombin,增加到GST与目的基因之间,后期可以很方便的将GST标签切除。

常见标签及功能应用如下:

Tag

氨基酸序列

大小(kDa)

功能

应用

FLAG

(1)DYKDDDDK
(2)DYKDDDD
(3)DYKDDDK

1

亲和、纯化

适用于基于抗体的纯化; 具有固有的肠激酶切割位点

HA

(1)YPYDVPDYA
(2)YAYDVPDYA
(3)YDVPDYASL

1.1

亲和

常用于蛋白质印迹,IPco-IPIF,流式细胞仪; 偶尔会干扰蛋白质折叠

Myc

EQKLISEEDL

1.2

亲和

经常用于蛋白质印迹,IPco-IPIF,流式细胞仪,但很少用于纯化,因为洗脱需要低pH

6His

HHHHHH

0.8

上海吉凯基因化学技术有限公司   商家主页

地址:上海市浦东新区张江高科技园区爱迪生路332号
联系人:陈先生
电话:18516626958/18621058196(企业用户)
传真:021-51370635
Email:marketing@genechem.com.cn;xin.chen@genechem.com.cn