蛋白结构研究分析

来源: 上海翊圣生物科技有限公司   2019-12-9   访问量:1439评论(0)

蛋白结构研究分析

一、研究背景

上个世纪初,科学家们认为蛋白质是生命体的遗传物质,而具有独特的作用。随着这个理论被证伪,真正的遗传物质DNA的结构被给予了很大关注。然而,蛋白质作为生命体的重要大分子,其重要性也从未被忽视,而且在1950年代开始,科学家一直在探寻DNA序列和蛋白质序列的相关性。与此同时,蛋白质测序和结构解析蛋白质结构的努力开始慢慢获得回报。更多的生化研究揭示了蛋白质的功能重要性,因此蛋白质的三维结构的解析对于深入理解蛋白质功能和生理现象起着决定性作用

图1:蛋白三维结构图

二、蛋白结构研究的发展

时间

科学家

事件

1958年

John Kendrew和Max Perutz

X射线衍射得到的高分辨率的肌红蛋白Myoglobin的三维结构,然后是更加复杂的血红蛋白Hemoglobin

1964年

Aaron Klug

提出了一种基于X射线衍射原理发展而来的全新的方法电子晶体学显微镜(crystallographic electron microscopy ),可以解析更大蛋白质或者蛋白质核酸复合体结构

1969年

Benno P. Schoenborn

提出可以用中子散射和原子核散射来确定大分子中固定位置的氢原子坐标。

1976年

Robert Langride

将X-ray衍射数据可视化,并在加州大学圣地亚哥分校成立了一个计算机图形实验室

1985年

John Deisenhofer等

德国科学家解析出了细菌光合反应中心,因此他们共享了1988年的诺贝尔化学奖。

2001年

Roger Kornberg

描述了第一个高精度的RNA聚合酶三维结构,正因此五年后他们共享了诺贝尔化学奖。

2007年,首个G蛋白偶联受体结构的解析更是对药物研究带了新的希望。近些年来,越来越多的大的蛋白质结构得到解析。Cryo-EM超低温电子显微镜成像用于超大蛋白质结构成像的研究日益成熟,并开始广泛用于蛋白质结构的解析

三、蛋白结构研究的意义

示例1:来自阿贡国家实验室等处的研究者利用高特异性的X射线晶体学技术解析了低氧诱导性因子(HIFs)的蛋白结构,低氧诱导性因子是肿瘤对低氧反应的重要调节子,该研究或为寻找新型药物切断癌细胞的氧气和营养供给最终治疗癌症提供新的思路

示例2A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)属于正黏病毒科,是一个有囊膜的、分节段的单股负链的RNA病毒,不同亚型流感病毒与受体的结合主要是靠HA蛋白实现的,HA与受体的结合具有种属特异性。在H7N9亚型流感病毒HA在演化过程中,它首先由禽特异性结合的G186Q226变成双受体结合特性的V186Q226,最后演变成V186L226,这些研究有利于深入理解H7亚型禽流感病毒跨种传播的分子机制,对于流感病毒疫情的预防与控制具有重要指导作用。

图2:H7N9 HA受体结合特性演化模式图

示例3非洲猪瘟是一个世界难题,有近百年的流行历史,由于没有疫苗和其他治疗手段,扑杀猪是眼下控制疫情最有效的方法。2019年,研究团队采用单颗粒三维重构的方法首次解析了非洲猪瘟病毒全颗粒的三维结构,阐明了非洲猪瘟病毒独有的5层(外膜、衣壳、双层内膜、核心壳层和基因组)结构特征,有这个理论的指导,可以帮助我们未来设计更安全、更有效的疫苗,从全球范围来讲,理论的意义是非常大的。

图3:非洲猪瘟的全颗粒结构

四、蛋白质结构解析的研究过程和实验方法

蛋白结构分析包含一系列产品的选择用于免疫印迹蛋白电泳蛋白定量蛋白色谱质谱

 

图4:蛋白结构研究过程

 

蛋白质结构解析的方法主要是两种,x射线衍射和NMR。

1、单晶培养技术及结构分析技术

1)蛋白质结晶方法

 

2)结构分析技术

(1)x射线衍射

x射线衍射是将表达蛋白的基因PCR之后克隆到一种表达载体中,然后在大肠杆菌中诱导表达,提纯之后摸索结晶条件,等拿到晶体之后,工作便完成的80%,将晶体进行x射线衍射,收集衍射图谱,通过一系列的计算,很快就能得到蛋白质的原子结构。

图5:x射线衍射原理

(2)NMR

首先通过基因工程的方法,表达出目的蛋白,提纯之后,摸索一下蛋白稳定的条件,如果蛋白没有聚合,而且折叠良好,便将蛋白样品(通常是1mM~3mM,500ul,pH6~7的PBS)装入核磁管中,放入核磁谱仪中,然后用一系列写好的程序控制谱仪,发出一系列的电磁波,激发蛋白中的H、N13、C13原子,等电磁波发射完毕,在收集受激发的原子所放出的“能量”,其实也是小磁场,通过收集数据、谱图处理、电脑计算从而得到蛋白的原子结构。

图6:血红蛋白结构建模

x射线与NMR技术特点

优点

缺点

x射线衍射

速度快:通常只要拿到晶体,甚至当天就能得到结构

不受大小限制:无论是多大的蛋白,或者复合体,无论是蛋白质还是RNA、DNA,还是结合了什么小分子

射线方法解析蛋白的瓶颈是摸索蛋白结晶的条件,

NMR

蛋白在液体中得到结构,是一个动态的结构,因为是动态就很容易的研究蛋白与其他蛋白或者配基的相互作用。

受大小的限制(上限是50kd。)

蛋白表达量要大,一定要在胞质中表达

蛋白要折叠。

(3)Cryo-EM超低温电子显微镜成像

近些年来,Cryo-EM被用来解析很多结构非常大(无法用X-ray解析)的蛋白质(或者蛋白质复合体),取得了非常好的结果。同时,单电子捕捉技术取代之前的光电转换成像的CCD摄像设备,减少了图像中的噪音和信号衰减,同时并增强了信号。计算机成像技术的成熟和进步,也赋予了Cryo-EM更多的进步空间。然而,Cyro-EM与X-ray不同,该方法不需要蛋白质成为晶体,相同的是都需要低温环境来减少粒子束对样品的损害。

图7:KIF1A残基和微管蛋白之间的相互作用。

 

五、蛋白结构相关产品信息

1、反转录

反转录是以RNA为模板,通过反转录酶,合成DNA的过程。是DNA生物合成的一种特殊方式。反转录是进行基因工程过程中,以RNA为模板提取出DNA遗传信息的过程

分类

产品名称

货号

规格

价格(

单酶

HifairTM II Reverse Transcriptase

11110ES92/93

1/5×10KU

626/2456

高灵敏度单酶

HifairTM III Reverse Transcriptase

11111ES92/93

1/5×10KU

1426/4626

Kit

HifairTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit

11119ES60

100T

755

高灵敏度Kit

HifairTM III 1st Strand cDNA Synthesis Kit

11135ES70

200T

1836

Kit(含gDNA去除步骤)

HifairTM III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)

11139ES70

200T

2196

预混液

HifairTM II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR

11120ES60

100T

855

高灵敏度预混液

HifairTM III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR

11137ES70

200T

2126

2、PCR试剂

聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DN**段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。

相关产品

分类

产品名称

货号

规格

价格(

PCR

HieffTM Taq DNA Polymerase

10101ES80/90

1/5 KU

155/735

HieffTM Robust PCR Master Mix(With Dye)

10106ES08

5mL

265

高保真PCR

Hieff Canace® High-Fidelity DNA Polymerase 高保真DNA聚合酶

10135ES60/76/80

100/500/1000U

626/2356/4256

Hieff Canace® Gold High-Fidelity DNA Polymerase 高保真DNA聚合酶

10148ES60/76/80

100/500/1000U

683/2383/4256

2×Hieff Canace® Gold PCR Master Mix高保真酶预混液

10149ES03/08

1/5mL

553/1453

热启动型PCR

HieffTM HotStart Taq DNA Polymerase (配体法热启动DNA聚合酶)

10110ES72/80

1/4×250U

186 /636

多重PCR

2× Hieff CanaceTM PCR Master Mix 高保真酶预混液 (for multiplex PCR)

10138ES03/08

1/5mL

625/2355

组织直扩PCR

Animal Tissue Direct PCR Kit 动物组织直接PCR试剂盒

10180ES50/70

50/200T

326/755

Mouse Tissue Direct PCR Kit (With Dye)

10185ES50/70

50/200T

323/982

3、分子克隆

在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DN**段的方法。常含有目的基因,用体外重组方法将它们插入克隆载体,形成重组克隆载体,通过转化与转导的方式,引入适合的寄主体内得到复制与扩增,然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体,可以得到插入DNA的许多拷贝,从而获得目的基因的扩增。

分类

产品名称

货号

规格

价格(

单个片段连接

Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit 一步法快速克隆试剂盒HOT

10911ES25/62

25T/5×25T

655/2455

1-5个片段连接

Hieff CloneTM Plus Multi One Step Cloning Kit 多片段一步法快速克隆试剂盒HOT

10912ES10/50

10T/5×10T

457/1967

替代TA连接克隆

Hieff CloneTM Zero TOPO-TA Cloning Kit 零背景TOPO-TA克隆试剂盒HOT

10907ES20

20T

625

Hieff CloneTM Zero TOPO-TA Simple Cloning Kit, MCS-Depleted

零背景TOPO-TA克隆试剂盒(不含MCS多克隆酶切位点)

10908ES20

20T

625

替代平末端连接克隆

Hieff CloneTM Zero TOPO-Blunt Cloning Kit 零背景TOPO-Blunt平末端克隆试剂盒HOT

10909ES20

20T

625

Hieff CloneTM Zero TOPO-Blunt Simple Cloning Kit

零背景TOPO-Blunt平末端克隆试剂盒(不含MCS多克隆酶切位点)

10910ES20

20T

625

4、抗生素

抗生素,是指由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产物,能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。

分类

产品名称

货号

规格

价格(

克隆筛选用抗生素

Carbenicillin, Disodium Salt 羧苄青霉素钠

60202ES08/25/60

5/ 25/100g

358/1428/4628

Ampicillin, Sodium Salt 氨苄青霉素钠

60203ES10/60

10/100g

108/968

5、蛋白浓度测定及SDS-PAGE胶

分类

产品名称

货号

规格

价格(

蛋白提取

RIPA Lysis Buffer (Strong) RIPA裂解液(强)

20101ES60

100ml

228

蛋白浓度测定

BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)

20201ES76/86/90

500T/2500T/5000T

288/818/1518

Bradford蛋白浓度测定试剂盒

20202ES76/86

500T/2500T

98/398

Marker

GoldBand 3-color Regular Range Protein Marker(10-180 kDa)三色预染蛋白质分子量标准

20351ES76/90

2×250/10×250 μL

585/1985

GoldBand 3-color Regular Range Protein Marker(10-245 kDa)三色预染蛋白质分子量标准

20352ES76/90

2×250/10×250μL

615/2315

预制胶

Precast Protein Improve Gels, 10 wells 高分辨率梯度预制胶,10孔

36231ES10

4%-20%,1盒(10块)

378

Precast Protein Improve Gels, 10 wells 高分辨率固定浓度预制胶,10孔

36233ES10

10%,1盒(10块)

378

 

6、蛋白纯化

蛋白纯化是生命科学研究 领域中一项重要操作技术,其广泛应用于蛋白功能、结构和相互作用的研究。翊圣生物提供全线蛋白纯化产品,包括纯化树脂、预装柱和层析空柱等,可高效、便捷分离纯化目的蛋白,为下游应用提供良好保证,更大范围满足您的实验需求

分类

产品名称

货号

规格

价格(

Flag亲和纯化凝胶

Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel(Anti-Flag亲和纯化凝胶

20585ES03/08/25/60

1/5/25/100 mL

1936/6236/27286/96756

His标签蛋白琼脂糖纯化树脂

HisSep Ni-NTA Agarose Resin (His标签蛋白琼脂糖纯化树脂)

20502ES10/50/60

10/50/100 mL

678/2848/5328

HisSep Ni-NTA Superflow Resin (His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂)

20503ES10/50/60

10/50/100 mL

798/3358/5838

HisSep Ni-NTA 6FF Spin Column, 5ML(His标签蛋白纯化预装柱)

20504ES08/25

5/5×5 mL

728/2938

HisSep Ni-NTA 6FF Spin Column, 1ML(His标签蛋白纯化预装柱)

20505ES03/08

1/5×1 mL

298/1048

Imidazole咪唑

20501ES60/76

100/500 g

223/553

GST标签蛋白琼脂糖纯化树脂

GSTSep Glutathione Agarose Resin 谷胱甘肽琼脂糖树脂

20507ES10/50/60

10/50/100 mL

928/3848/6898

GSTSep Glutathione Superflow Resin 谷胱甘肽高速纯化树脂

20508ES10/50/60

10/50/100 mL

1238/4568/7928

GSTSep Glutathione 4FF Spin Column, 1ML(GST标签蛋白纯化预装柱)

20509ES03/08

1/5×1 mL

328/1348

GSTSep Glutathione 4FF Spin Column, 5ML(GST标签蛋白纯化预装柱)

20510ES08/25

5/5×5 mL

938/3928

Glutathione,Reduced (GSH) 还原型谷胱甘肽(GSH)

60342ES10/60/80

10/100/1000 g

209/1156/4596

核酸酶

Benzonase Nuclease (Endotoxin-free) 全能核酸酶无内毒素

20125ES25/50/60

25/50/100 KU

1125/1965/3245

Benzonase Nuclease 全能核酸酶

20156ES25/50/60

25/50/100 KU

418/768/1398

六、其他产品

分类

产品名称

货号

规格

价格(

普通PCR

HieffTM PCR Master Mix (With Dye)

10102ES08

5mL

150

HieffTM Robust PCR Master Mix(With Dye)

10106ES08

5mL

265

HieffTM HotStart PCR Genotyping Master Mix(With Dye)

10108ES08

5mL

345

高保真PCR

Hieff Canace® Gold High-Fidelity DNA Polymerase 高保真DNA聚合酶

10148ES60/76/80

100/500/1000U

683/2383/4256

2×Hieff Canace® Gold PCR Master Mix高保真酶预混液

10149ES03/08

1/5mL

553/1453

热启动型PCR

UNICON™ HotStart Taq DNA Polymerase (抗体法热启动Taq酶)

10113ES60/76/88

100U/500U/3000U

216/656/3665

2×UNICONTM HotStart PCR Master Mix (With Dye)

10111ES03/08

5mL

432

2×UNICONTM HotStart PCR Master Mix(No dye)

10112ES03/08

5mL

432

多重PCR

HieffTM Multiplex PCR Kit(Mg2+ free)

13278ES50/76

100/500T

875/3165

HieffTM Multiplex PCR Kit

13279ES50/76

100/500T

875/3165

HieffTM Multiplex PCR Master Mix

13280ES50/76

50/200T

875/3165

5× Hieff CanaceTM PCR Master Mix 高保真酶预混液 (for multiplex PCR)

10137ES03/08

1/5mL

1215/3065

组织直扩PCR

Mouse Tissue Direct PCR Kit 小鼠组织直接PCR试剂盒

10181ES50/70

50T/200T

326/755

Animal Blood Direct PCR Kit 全血直接PCR试剂盒

10182ES50/70

50T/200T

326/755

Plant Tissue PCR Kit 植物组织直接PCR试剂盒

10183ES50/70

50T/200T

326/755

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T4 DNA Ligase T4 DNA 连接酶HOT

10301ES40

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11051ES80/84/92

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11801ES80/92

10 /100×100μL

166/1236

DH5α Chemically Competent Cell DH5α化学感受态细胞

11802ES80/92

10/100×100μL

166/1236

X-Gal 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷

10901ES03/08

1/5g

426/1746

X-α-Gal 5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷

10903ES25/60/72/76

25/100/250/500mg

399/769/1259/1979

蛋白标签切割酶

Enterokinase, Recombinant, Expressed in E. coli 大肠杆菌表达重组肠激酶(不带标签)

20401ES60/70/76

100/200/500 U

425/645/1245

Bovine Thrombin, High Specific Activity, >2000 IU/mg 牛凝血酶(高活力,>2000 IU/mg)

20402ES03/05

1/2 KU

536/956

rTEV Protease 重组烟草蚀纹病毒蛋白酶

20403ES80/92/10/50

1/10/10×1/50 KU

986/6756/7856/27556

HB191204

 



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